در بسیاری از مطالعات بیولوژی و همچنین تست‌های تشخیصی مولکولی (از جمله تست تشخیصی مولکولی Covid-19 و…)، نیازمند نوکلئیک اسید‌های DNA و یا RNA با خلوص بالا و کیفیت قابل قبولی هستیم. پروسه استخراج DNA و RNA در گذشته یکی از چالش های اصلی و اساسی در مطالعات مولکولی بوده است، اما امروزه به لطف پدیدآمدن شرکت های دانش بنیان و زیست فناور از جمله شرکت سینا ژن طب آزما و توسعه کیت‌های استخراج DNA و RNA، این چالش از پیش روی دانشمندان، محققان، آزمایشگاه‌های تحقیقاتی و بالینی برداشته شده و به سهولت تست های تشخیص مولکولی منجر شده است.
استخراج DNA
تاکنون روش‌های گوناگونی به منظور استخراج DNA از بافت، خون، CSF، سرم، پلاسما و… طراحی شده‌اند که 1) فنل-کلروفرم، 2) salting out و 3) solid phase extraction (Spin column-based nucleic acid purification) از جمله این روش‌ها هستند. برای انتخاب روش مناسب باید به عوامل زیادی از جمله مدت زمان استخراج DNA، سهولت انجام، بازدهی بالا، مقرون به صرفه بودن و همچنین نوع نمونه بیولوژیکی توجه کرد.
تمامی روش‌های استخراج DNA اعم از استخراج دستی و به وسیله کیت، ترتیب و اساس مشابهی دارند که شامل موارد زیر می‌شود:
- لیز سلولی و از بین بردن غشا و دیواره ها
- حذف پروتئین‌ها، لیپید‌ها و سایر مواد به غیر از نوکلئیک‌اسید ها
- خالص‌سازی DNA
در روش فنول-کلروفرم مرحله ی Removing contaminants با اضافه کردن Phenol Chloroform Isoamyl Alcohol صورت می‌پذیرد. پس از اضافه کردن فنول کلروفورم، محلول موجود در تیوب باید به وسیله ورتکس کردن و یا انجام عمل پیپتینگ به خوبی یکدست شود و پس از آن با دور 13,000 rpm سانتریفیوژ گردد تا DNA از سایر مولکول‌ها و مواد جدا شود.
در این مرحله پس از سانتریفیوژ محلول موجود در تیوب 3 فاز را تشکیل می‌دهد که فاز بالایی حاوی DNA و فازهای زیرین حاوی دیگر مواد است.
* روش فنول-کلروفرم یکی از روش های رایج برای استخراج DNA بوده است اما به دلیل اینکه کلروفرم یکی از خطرناکترین هیدروکربن‌های کلردار فرار است که بخار آن بسیار سمی و خطرناک است از این روش کمتر استفاده می‌شود. تنفس طولانی مدت این ترکیب می تواند کشنده باشد در نتیجه برای حفظ سلامتی و کاهش خطرات ناشی از آن، امروزه معمولاً از کیت ها و روش هایی که حاوی این ترکیب سمی است؛ استفاده نمی کنند.
در روش Salting out در این مرحله، از نمک غلیظ مانند NaCl 5M استفاده می‌شود که با اضافه کردن آن به پروتئین ها و محتوای سلولی، این مواد ته‌نشین شده و DNA ها به صورت محلول باقی می‌ماند.
در روش Solid phase (spin column-based DNA/RNA purification steps) همانند دو روش فنول-کلروفرم و Salting out ابتدا مرحله لیز سلولی انجام می‌شود. سپس محتوای سلولی حاصله به ستون های فیلتر داری از جنس سیلیکا منتقل می‌شود. این فیلتر ها به دلیل جنس خاص خود نوکلئیک اسید هارا به دام می‌اندازند و باقی مواد را از خود عبور می‌دهند. کیت استخراج DNA ویروسی شرکت سینا طب ژن آزما برای تخلیص DNA به روش Spin column طراحی شده است.
برای انجام فرآیند هایی همچون PCR، RT-PCR، تست تعیین هویت، تعیین توالی و … یکی از پیش نیاز های ضروری جدا کردن و تخلیص DNA می باشد که اهمیت استخراج DNA را دوچندان می‌کند.
استخراج RNA
همانند آنچه در مورد استخراج DNA صحبت کردیم استخراج RNA از بافت، خون کامل، پلاسما، سرم و … با روش های گوناگونی چون 1) فنل-کلروفرم، 2) salting out و 3) solid phase extraction (Spin column-based nucleic acid purification) انجام می شود. برای استخراج RNA باید به عواملی از جمله توجه به ناپایدار بودن RNA، مدت زمان استخراج، مقرون به صرفه بودن و بازدهی بالا توجه کرد.
تمامی روش های یاد شده اساس یکسانی دارند که شامل موارد زیر می شود:
- لیز سلولی و از بین بردن غشا و دیواره ها
- حذف پروتئین‌ها، لیپید‌ها و سایر مواد به غیر از نوکلئیک‌اسید ها
- خالص‌سازی RNA
روش مرسوم برای جدا سازی RNA در تست تشخیصی مولکولی Spin column ,Covid-19 است که از روش های فنول کلروفرم و Salting out بسیار سریع تر قابل انجام است و در انتها نوکلئیک اسید با غلظت مناسب و کیفیت بالا را تخلیص می‌کند.
کیت استخراج RNA ویروسی شرکت سینا طب ژن آزما، برای خالص سازی RNA ویروسی به روش ستون سیلیکا طراحی شده است. RNA ویروسی برای فرآیندهای دیگر مانند PCR, RT-PCR قابل استفاده است و همچنین برای استخراج انواع ویروس ها از جمله ویروس SARS-C0V-2 بهینه سازی شده است. از مزایای این کیت می توان به دارا بودن کمترین مراحل در استخراج RNA، حساسیت بسیار بالا، عدم نیاز به انکوباسیون های دمایی در زمان استخراج، عدم نیاز به تیمار با پروتئیناز K، کارایی قابل توجه، نرخ شکست پایین (failure rate)، دارای کمترین مواد سمی و سرعت استخراج بالا (کمتر از بیست دقیقه) اشاره کرد.
بدون دیدگاه